將由細胞之中抽出的 mRNA，以隨機引子或是含有 oligo(dT) 的引子進行 RT-PCR，再用適當的限制酵素切割，進行選殖。對已得到的各個菌株加以整理，以有系統的方式，對每一個菌株的插入片段，進行單一次自動化定序 (single-pass automatic sequencing)，所得到序列即被稱為表現序列標幟。因為只進行單向與單一次的定序，並未經過再一次的確認，而且一些無法由機器自動判斷的區域，可能也未以人工的方式予以校正，因此這種序列的特徵之一，就是含有不少的錯誤，比如說可能會含有不少鹼基的插入、刪除、以及不明確性，而且這種現象在愈接序列資料的 3’端愈明顯，因此在做序列比對時必須慎選程式使用。
圖1 EST序列的產生
除此之外，在選殖之時，表現量多的基因較容易被選殖到，表現量較少的基因則較不容易；然而表現量少的基因，有可能具有關鍵性的功能，這些基因是生命科學家特別感興趣的。要解決這個問題，一方面在選殖之時要進行常規化的處理(normalization)，另一方面則要以量取勝，也就是產生大量的 EST。
如果比較正常細胞與不正常細胞之間 EST 的質和量上的差異，或許可以找到產生病變的原因，做為開發新藥的契機，或是藉此改良品種，因此 EST 是非常具商業價值的。由於應用的層面有利可圖，所以許多生物科技公司分別開始有系統地決定 EST 的序列，以 Merck 公司支持的研究計劃為例，每週大約產生四千五百個 EST。在基因資料庫之中，己將所有的 EST 資料獨立成為 dbEST。dbEST 增長的速度非常的快(如圖表 1所示)，快速增長的 dbEST 已含有大約一百五十萬個 EST，已佔基因資料庫序列總數的百分之七十，若以鹼基總長度來計算，也超過百分之三十(根據 NCBI-GenBank Flat File Release 107.0 Release Notes 計算得到的數值，資料未顯示。可以用 ftp://ncbi.nlm.nih.gov/genbank/gbrel.txt 的方式取回最新資料)。
圖2 dbEST 所含有的序列總數和全部 GenBank 非 EST 序列總數的比較圖，1995 年之前的資料，是根據Boguski, M. S. 在 1995 年所發表的資料，1997 年、1998 年的數據，是來自 GenBank 的 Release notes。在1995年之後，EST 的序列總數便超過了全部序列總數的一半以上。
基因序列資料庫最吸引人的就是它巨大的資料量，但是由於在成立之時沒有經過良好的規劃，以致於累積了許多的重複序列資料，以致於無法很容易的由其中選出想要的資料。至於 EST 資料庫，這個問題就更嚴重了，因為EST的來源眾多，而且數量很大，可能具有高度的重複性，不同的 EST 可能對應至相近的實際基因體位置，不容易分辨在這個區域中基因的真實數目及位置。
因此，在未經整理的情況下，很難以直接使用這些 EST 資料，做為各個人類獨特基因的標幟。美國國家衛生院所屬的國家生物科技資訊中心 (National Center of Biotechnology Information，簡稱為 NCBI)為了要解決這個問題，便進行了一個實驗性質的計畫，目標是將重複的序列資訊合併，以造成一個不含多餘性序列資訊(non-redundant)的資料庫，稱之為 UniGene。
- 黃彥華 著
Last updated on 08/30/01